将横向扫描转换为轴向聚焦以加快3-D显微镜检查

a, 一束准直的激光束通过分束器(BS)传送到装置中，并传送到电流扫描镜(GSM)上，后者成像到一个空气物镜(OBJ1)的后焦平面上。扫描GSM可以一维光栅化焦点，如图所示，在OBJ1的盒前焦点空间的双头箭头所示。步进镜将不同散焦量的光反射回物镜中，物镜通过镜片进入GSM，在GSM上进行退扫描，去除横向扫描运动，只保留轴向部分。GSM然后再次成像到一个浸水物镜(OBJ2)的后焦平面上。OBJ2在样本空间中形成焦点的无像差图像(由OBJ1形成)。

b，从a放大到盒装区域。左边的面板显示了光在其标称焦点处的焦点。黑色箭头表示反射后返回的边缘光线。在镜面上的每一步都会在样品平面上产生一个轴向位置偏移的焦点。

c, 可选配置倾斜镜，允许连续轴向扫描。在这里，远端物镜OBJ1稍稍偏离光轴，以创建一个垂直入射到镜面的倾斜焦点。横向扫描这个焦点会导致焦点的变化，如黑色箭头所示。

     在光学显微镜中，高速体积成像受缓慢的轴向扫描速度或z扫描机制引入的像差的限制。为了克服这些限制，西南大学的科学家引入了一种新颖的光学设计，该设计将横向扫描运动转换为三维扫描。他们的显微镜实现了以12 kHz的频率进行激光聚焦，并可以观察斑马鱼胚胎中的细胞和跳动的心脏内部的快速动态。在显微镜、计算机视觉和激光加工中，快速成像非常重要。例如，在神经科学中，高速体积成像对于监视动态生物过程至关重要，包括膜电压活动（时间尺度为1毫秒或更短的动态）或脑血流。图像成像的速度与成像系统的焦点位置改变的速度紧密相关，尤其是在三维空间中。

       传统的重新聚焦方法是通过机械移动显微镜物镜或样品来实现的，这两种方法都会导致三维方向的扫描速度降低，因为移动物理对象的速度受到惯性的限制。解决此问题的一种潜在方法是通过远程聚焦，它可以通过更改光学系统的波前来实现重新聚焦。但是，大多数现有技术都面临着分辨率和速度之间的权衡。这样，仍然需要能够达到多kHz速率同时避免会降低其分辨率的像差的3-D扫描技术。

        在《光科学与应用》杂志上发表的一篇手稿中，来自美国德州达拉斯西南医学中心细胞生物学系和生物信息学系的Reto Fiolka教授领导的一组科学家。他的同事已经开发出一种新的光学设计来克服这些挑战。他们采用成熟的横向扫描技术，将横向扫描运动转化为三维聚焦，从而实现高速体积成像。他们采用了无像差远程聚焦的概念，不用在第三维中移动相应的远程反射镜，而是用高速电流计在固定的反射镜上横向扫描激光光斑。如果固定镜和物镜之间的距离沿扫描方向不是恒定的，将引入离焦，这是远程重新聚焦所必需的。此外，在返回路径上，对横向扫描分量进行了完美补偿，从而获得了三维的纯扫描运动。因此，研究人员能够利用高速横向扫描技术在三维空间快速移动高分辨率激光焦点。

a，两个MV3细胞内的遗传编码多聚体纳米颗粒，由ASLM在20 ms图像整合时间以3.57体积/秒的速度成像。b，核周区域的YZ视图。黄色圆圈表示检测到的囊泡，蓝色线表示累积的轨迹。c，斑马鱼胚胎示意图。d，以45 Hz的帧频获取的斑马鱼心脏的平均（超过30个周期）XZ横截面。e，跳动的心动图，沿d中所示的线测量。Kymograph使用原始数据，未应用平均。f，以7.4Hz的体积速率对斑马鱼心脏进行体积成像，XY深度用彩色编码。比例尺，a，10微米；b，1微米；d，e 20微米

  使用阶梯镜和倾斜平面镜的两种实现方式来实现这一概念。前者允许在有限数量的步骤上任意选择较大的轴向步长，而后者允许任意数量和大小的轴向步骤，即使在更受限的扫描范围内，也可以在三维中进行连续扫描。通过这两种方式，科学家介绍了该技术的应用：

  “我们在显微镜成像方面的第一个实际演示是加速轴向扫掠光片显微镜（ASLM），该技术因其采集速度慢（以前在高分辨率应用中帧速率约为10 Hz，而受到批评）。我们的新扫描技术允许一个数量级的加速度，同时保持这一新兴成像技术的高空间分辨率。在第二个应用中，我们在双光子光栅扫描显微镜中实现了我们的扫描技术，并以12 kHz的第三维扫描率进行了高分辨率的体积成像。事实上，在这种空间分辨率下，我们的方法比以前报道的无像差聚焦技术快6倍。然后，我们通过成像斑马鱼胚胎跳动的心脏，展示了我们的技术在活体显微镜下的潜力。我们相信，这为静脉成像开辟了重要的应用领域，特别是在神经科学领域。”