三光子显微镜用于亚表面组织成像

脉冲可调谐激光器是生命科学中用于多光子成像的普遍工具，大多数研究都采用双光子技术。近年来，出现了一种使用三光子荧光的新型成像技术，可以对组织样本的表面进行更深的扫描，从而揭示有关基础细胞结构（例如神经元或血管）的信息。三光子成像比双光子成像能够更深入地穿透组织，因为产生三光子效应所需的激光具有更长的波长。光的波长越长，发生的散射越少，因此可以在更深处获得更清晰的结构图像。由于不同深度的大脑功能不同，这在神经科学中尤其重要。

什么是三光子成像？

在双光子成像中，一对低能红外光子同时被荧光分子吸收，从而将其激发到更高的能量状态。此时，它松弛并发出高能可见光子。顾名思义，三光子成像需要同时吸收三个低能光子以实现相同的分子激发。

三光子成像只有通过利用穿过组织的特定透射窗才可能实现，该组织的波长区域因水和氧化血红蛋白引起的吸收很低，光学瑞利散射和米氏散射被最小化。在近红外中已经发现了几个窗口，特别是在1.3和1.7微米附近。这些波长是理想的，因为它们还可以在现有的荧光团（例如绿色和红色荧光蛋白（GFP和RFP））中吸收三光子。

一切都取决于时机

三个光子的同时吸收必须在一个飞秒内发生，这就要求样品平面中的光子密度要高于使用标准80 MHz飞秒激光器所能达到的密度。如果样品的平均功率过高，那么高的光子密度会导致光损伤和光漂白，因此激光的能量就变得至关重要。许多小组的广泛工作推出了以下推荐的激光参数：

l 在100 kHz至5 MHz的重复频率之间

l 样品平面上的低于150 fs脉冲（需要显微镜前压缩）

l 显微镜物镜后低于50 mW（以防止损坏）

l 200 nJ脉冲能量

满足该规格的商用工具是由高功率光纤激光器泵浦的光学参量放大器（OPA）。OPA的核心是单通波长转换器，它将来自光纤激光器的光子在一个非线性晶体中分离出来，产生两个新的低能量，长波长输出。光谱输出是宽带的，并且支持短脉冲，而且可以通过旋转非线性晶体来选择精确的波长。

虽然OPA可以满足上述要求，但其代价相当大，需要一个40w的泵浦激光器来启动非线性转换过程，并且当与OPA结合使用时，在空间狭窄的实验室中，激光器的占地面积会受到限制。

一种新方法

 英国爱丁堡Heriot-Watt大学的研究人员获得了科学与技术设施委员会(STFC)颁发的35万英镑的奖励，用于开发一种紧凑、低成本的OPAs替代品，为那些买不起三光子显微镜技术的研究人员打开了新领域。该项目的合作伙伴包括显微镜制造商Scientifica和Chromacity，它们设计和制造适用于各种工业和基础研究应用的超快激光器。该联盟将共同完成紧凑型飞秒激光器的十年研究，从而为深组织成像提供新的来源。

这项名为“深层组织”的为期三年的项目是在Heriot-Watt大学光子学与量子科学研究所（IPAQS）进行的研究的基础上，制造出一种能够将组织数据收集到一定深度的激光器，该激光器的深度是目前市场上现有激光器的两倍，而成本大约是三分之一。

该项目希望通过提供一种成本大大降低的专业技术，开辟一系列新的研究领域。廉价的用于深部组织成像的激光器的商业化将使整个生命科学领域的研究人员受益，包括神经科学等领域，在该领域中，已经通过完整的小鼠头骨对大脑进行了成像。

由于合适的激光系统的成本过高，因此尚未确定该技术的未来应用，但这项合作将消除这一发展障碍。

从天文学到显微镜

STFC正在其创新合作计划（IPS）下为该项目提供资金，该计划旨在将使用STFC资金开发的技术推向市场。自2014年以来，IPAQS一直在开发由STFC资助的用于天文光谱仪校准的精密激光器。

天文校准器仅需要几厘米长的激光腔，就具有极高的公差要求，现在，这种知识已被转化为用于高能显微镜的激光开发。IPAQS在紧凑型光学系统设计方面的专业知识以及对可调谐脉冲激光器的先前研究使“深层组织”项目得以推进。

开展新的研究

“深层组织”项目将为科学界提供一个强大的新工具，并有可能开拓包括再生医学，白血病和阿尔茨海默氏症在内的许多新研究领域。激光甚至可以用于在水稻和小麦等植物的根部成像，以识别阻碍生长并降低农作物生产力的细菌。目前，想要进行这项研究的公司必须购买能够进行各种分析的激光器，这意味着需要额外的费用。

“深层组织”项目旨在创建经过精心设计以执行一组特殊任务的激光器。这意味着可以开发和投资必要的组件，从而大大降低了总体成本，同时为最终用户提供了更大的范围来实现他们的研究目标。